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详细介绍下原代细胞的复苏步骤

发表时间:2022-03-04 14:54

  细胞通常在-196°C的温度下存储在液氮中,理论上具有无限的存储时间。细胞冷冻和复苏的基本原理是缓慢冷冻和快速解冻。实验表明,这可以显着维持细胞活力。细胞恢复是将原本冷冻保存(冻结)的细胞恢复为正常增殖状态的过程,今天我们来看看原代细胞的复苏步骤。

原代细胞

  一、检查

  收到细胞系包装时,请检查细胞系冷冻管是否已解冻。 如果已解压缩,请立即处理并告知发件人。尽快开始培养细胞系或立即冷冻(在–70°C下储存过夜并转移到溶液N2中)。

  二、冷冻细胞解冻

  1.根据基础培养基类型,血清类型以及细胞系声明中指定的其他指定成分和比率,准备培养基。

  大多数细胞不能轻易适应不同的基础培养基或不同类型的血清。如果由于实验的需要而有所不同,请缓慢而逐渐地改变培养基的成分。细胞适应并进行必要的实验。

  2. FBS(胎牛血清),CS(小牛血清,小牛血清),HS(马血清,马血清)因细胞而异。确保根据细胞系信息中列出的血清类型培养细胞。

  3.将培养基放入37°C的水箱中加热,用70%的酒精喷洒,加热后擦去,然后将其转移到无菌手术台上。取下冷冻管,立即将其放入37°C的水箱中以快速融化。水位不应接近或高于冷冻管的盖子。否则,很可能发生污染。轻轻摇动冷冻管,使其在1分钟内完全溶解,用70%的乙醇擦拭冷冻管的外部,然后移至无菌手术台上。

  4.根据细胞类型和浓度,在无菌手术台上的T25或T75烧瓶中加入10 ml培养基。取出融化的细胞悬液,缓慢地将培养基添加到T25或T75烧瓶中,充分混合,然后在5%CO2孵育箱中于37°C孵育。

  5.在大多数细胞中,少于1%的防冻DMSO不会对细胞附着或激活产生不利影响。不需要立即将其从解冻的细胞中取出。第二天确认细胞生长或附着。卸下后将其牢固安装。

  对于非常少数对DMSO敏感或引起细胞分化的细胞,如果需要立即去除DMSO,请将解冻的细胞悬液置于5-10 ml培养基和300 xg(约)中,以1000 rpm离心5分钟,然后小心取出。向上清液中添加适量的新鲜培养基,将细胞均匀混合,转移至培养瓶中,并在5%CO2培养箱中于37°C孵育。

  3.如何处理T25烧瓶细胞

  1.在运输过程中,用培养基填充所有T25烧瓶,以防止起泡,细胞脱落和死亡。检查烧瓶的外观,并在显微镜下观察细胞生长和污染。如果有问题,请勿打开盖子。请立即与细胞实验室联系。

  2.将原始的T25烧瓶放入37°C的5%CO2培养箱中,将细胞加热至37°C,然后重新附着并增殖在运输过程中脱落的少量细胞。

  第二天,将培养瓶中的培养物移至无菌技术箱中(去除的培养基可重复使用),留出约5-10 ml进行基于培养瓶的培养,然后根据常规方法将细胞置于培养箱中。或者,如果细胞穿过板,则将细胞传代培养。

  四,细胞复苏注意事项

  1.在整个恢复过程中更加灵活。如果前面太长,可能会影响愈合效果。

  2.使用镊子,因为“除冰”过程中冷冻管与水之间的温差太大,尤其是液氮冷冻保存管,浸入水中会影响视力。冷冻管。将沉淀管推入水中,以便即使破裂也可以作为缓冲液存在。

  3.小心冻伤,尤其是在夏天卸下冷冻管时。尽管有热量,还是需要穿上长袖的实验室外套。疏忽大意的运动会导致一小块新鲜的肉“粘”在冰箱门上。

  4.离心步骤也可以在冷冻管中的冰融化后立即进行。也就是说,将冷冻管直接离心,离心后将原来的冷冻保存液丢弃,然后直接添加完全培养基以重悬细胞。将细胞转移到培养皿/烧瓶中进行培养。此方法可能无法干净地除去DMSO,但效果不大。

  5.不要忘记在恢复的第二天检查细胞。如果条件良好,则恢复成功。


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